高效液相色譜有四方面重要的作用。
① 分離分析藥物的組分含量：由于一種藥劑常含有多組分，一次即可將各維生素B6、D1、A、E同時分離并定出含量。又如止痛藥或退燒藥也可用此法分離并測得各組分的含量。
② 藥物生產中進行中間控制：生產抗菌素時，首先要了解發酵液中的主體與付產物的存在情況。例如：青霉素、四環素、頭孢子菌素、紅霉素、柔紅霉素、慶大霉素等的發酵產物，均可用C18柱和甲醇及緩沖液配制的流動相或用離子對法，分析主體及其收產物的含量。對普魯卡因酰胺、茶堿等可進行主體含量的測定，對硝酸甘油可測定主體含量及其降解產物，以便保證藥物的熱量。
③ 分析藥物在體內的殘量：這是近來研究新藥效能很主要的內容之一，如冬凌草甲素是植物中的一組分，有抗癌效果，但是毒性大。測定其在血清中含量很重要，現在可用C18柱及甲醇水為流動相，測定處理后的血清樣品，即可得到血中的含量。如磺胺類藥品在血清及尿中含量也不允許太大，可用C18柱及酸性乙醇為流動相，測定含量后，則可估計最合適的用藥劑量。又如四環素、巴比妥酸、止痛藥、退燒藥、護糖尿病的藥物等，在血或尿中的含量都可用C18柱用甲醇、水為流動相來測定含量。因此，反相色譜法應用范圍極廣。
④ 測定藥物在各種器官中的代謝產物，特別是研究藥物的代謝產物在血清中存在的情況。如測血清中的酮酸及戊二酸。測尿中代謝產物更為方便，不需要繁鎖的預處理。因為研究尿中的組分能鑒別病人的代謝功能，對病理研究或監床診斷均具有重要的參考價值。
